OBJETIVO
Separar los distintos componentes de una sustancia para identificarlos y cuantificarlos.
FUNDAMENTO
La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente, dependiendo de la capacidad de dichos productos para disolverse en la fase móvil y la capacidad de la fase estacionaria para retenerlos. De esta manera se separan los componentes y, en función de la distancia de migración, es decir, el valor de recorrido relatico (Rf), podemos identificar cada sustancia, puesto que es un dato característico de cada una.
MATERIALES
- Láminas de gel de celulosa
- Disolvente de cromatografía
- Disolución reveladora: ninhidrina
- Muestra problema (contenido desconocido de aminoácidos)
- Muestra patrón (contenido conocido de aminoácidos)
- Vaso de precipitado
- Micropipeta
- Atomizador
- Lápiz blando
- Regla
PROCEDIMIENTO
Primero, colocamos el disolvente en el vaso de precipitado hasta que contenga 1 cm como máximo.
Después, cogemos una placa de gel de celulosa (tocar por los bordes para evitar dejar huellas que afecten a la técnica), y con un lápiz muy blando, hacemos una línea a 1,5 cm, donde colocaremos los puntos de muestras (2 µL) con 1 cm de separación entre ellas, teniendo la placa en posición horizontal. Después, dejaremos que se sequen los puntos al aire.
Una vez puesto los puntos con la separación correcta y secos, introducimos la placa en el vaso de precipitado de forma vertical dejando las muestras en la base (asegurándonos de que no entren en contacto las muestras con el disolvente), tapamos y esperamos entre 30 y 60 minutos para que el disolvente ascienda por capilaridad por la lámina.
Cuando el frente del disolvente haya subido lo suficiente (8 cm aproximadamente), retiramos la lámina del vaso, marcamos con el lápiz donde está el frente del disolvente y dejamos secar al aire o con la ayuda de una estufa.
Con la placa ya seca, pulverizamos con el revelador de ninhidrina de manera uniforme, e introducimos la placa en la estufa un par de minutos para que actúe el revelador.
Por últimos, medimos con la ayuda de una regla la altura desde el frente de precipitado o desde la base (pero todas las medidas desde el mismo punto de partida) hasta el centro del circulo formado por los aminoácidos separados y revelados.
RESULTADOS
Para poder identificar los aminoácidos de esta mezcla, tenemos que averiguar su Rf con la siguiente formula:
Aplicando esta fórmula, obtenemos los siguientes valores:
- Rf1 = 0.38
- Rf2 = 0.55
- RF3 = 0.77
INTERPRETACIÓN
Según estos Rf, podemos determinar que:
- Rf1 à Glutamina
- Rf2 à Arginina
- Rf3 à Alanina
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