ELISA

OBJETIVO

Determinacion cuantitativa de hormona tiroidea TSH.

 

FUNDAMENTO

Se basa en la detección de la hormona TSH (que actúa como antígeno) mediante la unión a un anticuerpo anti-TSH sensibilizado en una placa de microtitulacion y posterior revelado mediante la adición de un segundo anticuerpo anti-TSH pero conjugado con un cromógeno (complejo enzima-sustrato) y cuantificación en función de la cantidad de color detectada por el lector de placas (por espectrofotometría).

 

MATERIALES

• Papel de filtro
• Vaso de precipitado
• Micropipeta
• Puntas de Micropipeta
• Placa de microtitulacion (96 pocillos)
• Lector de placas
• Agua destilada
• Pocillos de ELISA para determinación de TSH
• Muestra: suero

  

  Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

• Patrones:
  • Patrón 1: 0 µUi/mL
  • Patrón 2: 0.1 µUi/mL
  • Patrón 3: 0.5 µUi/mL
  • Patrón 4: 2 µUi/mL
  • Patrón 5: 5 µUi/mL
  • Patrón 6: 10 µUi/mL
    

    

    

    

    

    

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

•  Reactivo:
  • Anticuerpos anti-TSH conjugados con peroxidasa
  • Sustrato TMB
  • Solución de parada (solución stop)
    

    

    

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

 

PROCEDIMIENTO

1. Colocar los pocillos que se van a utilizar sobre la placa de microtitulacion
2. Depositar 100 µL de cada patrón y cada muestra en pocillos diferentes
3. Añadir el anticuerpo anti-TSH conjugado
4. Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas
5. Eliminar la muestra de los pocillos mediante 5 lavados añadiendo 200 µL de agua destilada y vaciando los pocillos bien entre un lavado y otro (sacudir si es necesario)

   

   Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

6. Añadir 100 µL de TMB y agitamos 5 segundos
7. Se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos
8. Se añade la solución de parada y se agita 30 segundos (debe cambiar el color a amarillo)
9. Se lee en el lector de placas ajustado a 450 nm

 

RESULTADOS

Hacer una curva de calibración con las concentraciones de los patrones y las absorbancias obtenidas tras la realización de la técnica.

Las absorbancias de los patrones son:

• Patrón 1: 0
• Patrón 2: 0.105
• Patrón 3: eliminado el resultado por no cuadrar con lo que debería
• Patrón 4: 0.256
• Patrón 5: 0.466
• Patrón 6: 0.818

Esta es la gráfica resultante:

Fuente: elaboracion propia mediante Excel

Para calcular las concentraciones de las muestras, debemos despejar la incognita correspondientes (X) en la formula obtenida en la gráfica.

En nuestro caso, las muestras son:

• Muestra 1: 0.161 (1.2 µUi/mL)
• Muestra 2: 0.157 (1.176 µUi/mL)
• Muestra 3: 0.148 (1.058 µUi/mL)

 

INTERPRETACIÓN

Los valores de referencia deben rondar entre:

• Normal: entre 0.07 y 1.84 µUi/mL
• Hipertiroidismo: <0.07 µUi/Ml
• Hipotiroidismo: >1.84 µUi/mL

Según esto, nuestros valores de todas las muestras se encuentran dentro de los valores normales.

 

PRECAUCIONES

• Respetar adecuadamente los tiempos para que los resultados sean lo mas precisos posibles.
• Cambiar las puntas de pipeta cada vez que se pipetea para evitar contaminaciones entre las distintas muestras y controles.
• Debemos introducir los valores adecuadamente en la gráfica de calibración.
• Tener cuidado al despejar la formula para calcular las concentraciones de las muestras a analizar.
• Todo debe estar adecuadamente etiquetado para evitar errores en la interpretación de los resultados por error en los pacientes a los que pertenece cada muestra.

 

BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA

IMÁGENES: las imágenes aportadas a en este PNT para su realización son realizadas por mi en el laboratorio del instituto I.E.S. Albaida.

INFORMACIÓN:

• Protocolo obtenido del profesorado del instituto I.E.S. Albaida
• Wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:Portada
• Blog de laboratorio clínico: http://laboratorioareaclinica.blogspot.com/search/label/Tinciones%20bacteriol%C3%B3gicas