Tinción Gram

OBJETIVO

Tinción de bacterias Gram+ y Gram- para diferenciarlas visualizándolas al microscopio.

 

FUNDAMENTO

Esta tecnica de tinción, se basa en la capacidad de las gram+ (debido a su estructura externa de peptidoglicano) de conservar el color una vez teñidas, al contrario que las Gram-, que se pueden decolorar fácilmente. Esto hace posible la tinción de ambos grupos de bacterias pero con coloraciones diferentes, por lo que pueden ser diferenciadas fácilmente al microscopio.

 

MATERIAL

• Papel de filtro
• Portaobjetos
• Frasco lavador
• Barras paralelas
• Cubeta de tinción
• Asa de siembra
• Pipetas pasteur
• Mechero bunsen
• Mechero
• Gradilla
• Agua destilada
• Muestra (cultivo bacteriano en agua de peptona)
• Colorantes:
  • Cristal violeta
  • Lugol
  • Alcohol-acetona
  • Safranina

PROCEDIMIENTO

1. Encender el mechero bunsen con la ayuda de un mechero para crear un área de esterilidad.
2. Esterilizar el asa de siembra por flameado con el mechero bunsen y coger una muestra representativa de la muestra.
3. Colocar la muestra sobre el portaobjetos y extenderla bien. Si es en medio liquido, colocaremos la muestra directamente sobre el porta; sin embargo, si es un cultivo sobre medio solido, colocaremos sobre el portaobjetos una gota de suero previamente, sobre la que colocaremos y extenderemos la muestra.
4. Una vez colocada la muestra, esterilizar de nuevo el asa de siembra.
5. Pasar la extensión por el mechero bunsen para que se seque y se fije.
6. Colocar el portaobjetos sobre las barras paralelas.
7. Aplicar con la ayuda de una pipeta pasteur cristal violeta sobre toda la muestra cubriéndola por completo durante 1 minuto.
8. Escurrir la muestra y lavar con el frasco lavador con abundante agua destilada, con cuidado de no arrastrar la muestra.
9. Aplicar el mordiente, lugol con la ayuda de una pipeta pasteur sobre toda la muestra cubriéndola por completo durante 1 minuto.
10. Escurrir la muestra y lavar con el frasco lavador con abundante agua destilada, con cuidado de no arrastrar la muestra.
11. Aplicar alcohol-acetona con la ayuda de una pipeta pasteur sobre toda la muestra cubriéndola por completo durante 30 segundos. Para decolorar las Gram-.
12. Escurrir la muestra y lavar con el frasco lavador con abundante agua destilada, con cuidado de no arrastrar la muestra.
13. Aplicar la safranina con la ayuda de una pipeta pasteur sobre toda la muestra cubriéndola por completo durante 2 minutos.
14. Escurrir la muestra y lavar con el frasco lavador con abundante agua destilada, con cuidado de no arrastrar la muestra.
15. Dejar secar la muestra al aire.

RESULTADOS

Los resultados son bacterias teñidas de color violeta, y otras teñidas de color rosa rojizo.

 

INTERPRETACIÓN

La interpretación de estos resultados son que las bacterias con una coloración violeta son bacterias Gram+, y las de color rosa rojizo  Gram-, lo que nos permite distinguir unas de otras facilmente con la ayuda de un microscopio.

 

PRECAUCIONES

• Tener cuidado al fijar la muestra en el porta con la llama del mechero bunsen, si nos pasamos puede romperse el vidrio.
• no encender el mechero bunsen con guantes puestos, es fácil que se prendan fuego.
• Al abrir y al cerrar el tubo de medio liquido con la muestra, calentar la boca para conservar las condiciones del cultivo en el interior del tubo.
• Tener todo ordenado encima de la mesa, por ejemplo, las cosas que vayamos a usar con la mano izquierda, a la izquierda, y las cosas que vayamos a usar con la mano derecha, a la derecha; de esta manera evitamos cruces de menos, y posibles contaminaciones y accidentes.