Difusión simple en tubo y placa petri

OBJETIVO

Detectar antígenos proteicos en una muestra de suero aplicando una reacción de precipitación.

 

FUNDAMENTO

El método se basa en la reacción interfásica que se produce cuando en un pequeño tubo o en una placa Petri, se colocan sucesivamente y evitando que se mezclen las soluciones de antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) que se corresponden.

 

MATERIALES

• Agar-agar
• Vaso de precipitado
• Iman
• Agitador magnético
• Tubos de ensayo o placas Petri (o ambos)
• Agua destilada
• Guantes térmicos
• Gradilla para tubos de ensayo
• Muestra problema (suero)
• Balanza
• Probeta
• Varilla agitadora
• micropipeta

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

PROCEDIMIENTO

Primero vamos a explicar la preparación del agar-agar que necesitamos como medio para que se produzca la reaccion. Este medio de agar, debería de llevar anticuerpos (Ac), que nosotros no le añadimos porque simplemente era una práctica para ver cómo se produciría la difusión:

1. Con la ayuda de una balanza pesamos el agar según la cantidad que vayamos a preparar mirando las indicaciones que vienen en el envase.
2. Se mida la cantidad de agua necesaria con una probeta.
3. Se mezcla el agua destilada y el agar con una varilla agitadora en un vaso de precipitado.
4. Se pone la disolución a calentar en el agitador magnético con el imán en el interior de la disolución a 300 rpm y a 100ºC. dejar hasta que comience a hervir y retirar justo antes de que subo y se desborde del recipiente.
5. Verter el preparado en los tubos de ensayo (3/4 partes) y en las placas Petri (cubrir toda la superficie); y dejar enfriar a temperatura ambiente.

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

A continuación, vamos a preparar las disoluciones de azul de metileno que nosotros usaremos sustituyendo al suero, para que sea la precipitación más visible en la práctica. Hay dos tipos:

            Peso/volumen

1. Medimos 0,1g de azul de metilo en polvo.
2. Echamos un poco de agua en un vaso de precipitado y le añadimos el azul de metileno medido previamente. Lo mezclamos bien.
3. Vertemos la disolución en un matraz aforado de 100Ml y llenamos con agua destilada hasta enrasar. Taponar y mover.

            Volumen/volumen

1. Cogemos 0,1mL de azul de metilo liquido con la ayuda de una pipeta.
2. Echamos un poco de agua en un vaso de precipitado y le añadimos el azul de metileno medido previamente. Lo mezclamos bien.
3. Vertemos la disolución en un matraz aforado de 100Ml y llenamos con agua destilada hasta enrasar. Taponar y mover.

Una vez listos los tubos o placas Petri y el suero (en nuestro caso la disolución de azul de metileno), introducimos 150µL de suero los tubos, en la superficie del gel; o en haciendo pocillos en las placas de Petri.

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

RESULTADOS

En los tubos, se ve como la disolución baja por el tubo, precipita, al haber hecho una disolución de azul de metileno se ve perfectamente.

En las placas de Petri, la disolución se expande de forma radial de donde la habíamos colocado.

 

INTERPRETACIÓN

Si fuese una muestra real de suero y un medio de agar preparado con anticuerpos, podríamos ver cómo tanto en los tubos como en las placas Petri se producen relaciones Ag-Ac al entrar en contacto la muestra precipitando en el tubo por el agar, y extendiéndose de manera circular en las placas.

Esto supondría la presencia de un determinado antígeno, en función del anticuerpo empleado en la preparación del medio de agar.

 

PRECAUCIONES

• Etiquetar correctamente todo lo utilizado durante la practica.
• No contaminar muestras y reactivos.
• Leer bien las indicaciones de los reactivos y productos utilizados.
• Desechar correctamente los residuos.
• Atemperar los reactivos y las muestras utilizados.
• Mirar las indicaciones de casa producto en los envases para evitar errores.
• Usar guantes térmicos al retirar la preparación de agar-agar, para evitar quemarnos
• Tener cuidado con medio de agar-agar cuando se esta calentado, cuando llegue a la temperatura de ebullición sube muy rápido y hay que retirarlo del fuego enseguida.

 

INFOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA

IMÁGENES: las imágenes aportadas a en este PNT para su realización son realizadas por mi en el laboratorio del instituto I.E.S. Albaida.

INFORMACIÓN:

• Protocolo obtenido del profesorado del instituto I.E.S. Albaida
• Wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:Portada
• Blog de laboratorio clínico: http://laboratorioareaclinica.blogspot.com/search/label/Tinciones%20bacteriol%C3%B3gicas