OBJETIVO
Determinar de manera cuantitativa, la cantidad de glucosa presente en suero mediante espectrofotometría.
FUNDAMENTO
Mediante la adición a la muestra de unos reactivos, conseguimos que la glucosa presente en el suero se transforme en 6-Fosfogluconato, de tal forma, que queda también como resultado NADH. Mediante la cuantificación de este NADH por espectrofotometría, podemos calcular la cantidad de glucosa que había en la muestra antes de provocar la reacción.
MATERIALES
- Micropipetas
- Puntas de pipeta
- Reactivos:
- R1: TRIS (Ph 7,5) + ATP + Mg(2+)
- R1: NAD(+) + Hexoquinasa(HK) + Glucosa-6-fosfato(G6D-DH)
- Patrón: calibrador primario de glucosa 100 mg/Dl
- Muestra (suero)
- Cubeta de espectrofotómetro (1cm paso de luz)
- Gradilla para cubetas de espectrofotómetro
PROCEDIMIENTO
Primero vamos a preparar el reactivo de trabajo, para ellos, tenemos que combinar el R1 con el R2 en un mismo recipiente mezclándolo suavemente para homogeneizar bien el reactivo de trabajo (RT).
A continuación, preparamos 3 cubetas de espectrofotometría con los siguientes contenidos:
- Blanco: 1 ml de RT
- Patrón: 1 ml de RT + 10 µL de patrón
- Muestra: 1 ml de RT + 10 µL de muestra
Para que las cubetas estén correctamente preparadas, debemos de homogeneizar con la pipeta, asegurándonos de que todo quede perfectamente mezclado y sin burbujas. Después de esto, debemos de dejar 10 minutos incubando para que se terminen completamente las reacciones.
Ajustamos el espectrofotómetro a 340 nm y ponemos a 0 frente a la cubeta con el blanco reactivo preparado previamente.
Medimos los valores de absorbancia de las cubetas con patrón y muestra, y los apuntamos debidamente identificados.
Apagamos el equipo y calculamos la concentración de la muestra mediante la aplicación de la formula siguiente:
((A)muestra/(A)patrón) x 100 (C. patrón) = mg/Dl de glucosa en la muestra
RESULTADOS
Absorbancia del patrón: 0,126
Absorbancia de la muestra: 0,800
Concentración: (0,800/0,126)x100= 634,92 mg/Dl
INTERPRETACIÓN
Nos ha salido una concentración de glucosa atípica, muy por encima de los valores normales.
Este hecho seguramente se deba a un fallo en la preparación de las cubetas, como por ejemplo un mal pipeteo. Otro fallo puede ser, no haber esperado el tiempo necesario para que se produzca la reacción necesaria para la formación de NADH.
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