Determinación de glucosa GOD-POD (Espectrofotometría de absorción)

 

OBJETIVO

Cuantificación de glucosa en suero.

 

FUNDAMENTO

Para esta técnica nos basamos en la medición mediante espectrofotometría de la concentración de NADH en el suero. De esta manera, el aumento de la concentración de NADH es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra.

 

MATERIAL

• -Micropipeta
• -puntas de Micropipetas
• -Cubetas de espectrofotometría
• -Espectrofotómetro
• -Gradilla para cubetas de espectrofotometría (1cm paso de luz)
• -Muestra: suero
• -Patrón: calibrador primario de glucosa 100 mg/dL
• -Reactivos:

Reactivo 1 (tampón): TRIS pH 7,5, ATP Y Mg²⁺

Reactivo 2 (enzima): NAD⁺, hexoquinasa (HK) y glucosa-6-fosfato (G6F-DH)

 

PROCEDIMIENTO

Conectamos el espectrofotómetro a la corriente eléctrica y lo encendemos mediante el interruptor unos minutos antes para que se estabilice el equipo.

Después, tenemos que preparar el reactivo de trabajo (RT). Para ello, disolvemos el contenido de un vial de R2, en un frasco de R1, tapamos y mezclamos con suavidad hasta que quede bien homogenizado

A continuación, preparamos 3 cubetas de espectrofotometría con los siguientes contenidos:

• Blanco: 1 ml RT
• Patrón: 1 ml RT + 10 µL patrón
• Muestra: 1 ml RT + 10 µL muestra

Mezclamos bien los contenidos de las cubetas e incubamos 10 minutos a temperatura ambiente.

Ajustamos el espectrofotómetro a una longitud de onda de 340nm y lo ponemos a 0 frente a una cubeta con agua destilada.

Para finalizar, medimos la absorbancia de las 3 cubetas preparadas anteriormente, y realizamos las cuentas correspondientes para obtener la concentración de NADH y, por tanto, la de glucosa, puesto que es directamente proporcional, mediante la siguiente formula:

 

RESULTADOS

Los datos obtenidos mediante espectrofotometría son:

1. blanco = 0.048
2. patrón = 0.185
3. muestra = 0.895

Aplicando la formula obtenemos que:

 

INTERPRETACION

Los valores obtenidos en esta prueba, se encuentran muy por encima de los rangos normales, tanto que sobrepasa el límite de linealidad establecido en 600mg/dL. Por esta razón, habría que comprobar si la prueba la hemos realizado bien, ya que puede ser un error de pipeteo, o también podría ser un error por las malas condiciones de los materiales, ya sean reactivos o equipo empleado en la técnica.