Tinción Wirtz-Colin

OBJETIVO

Tinción de esporas y endoesporas bacterianas para su observación al microscopio.

 

FUNDAMENTO

Esta se basa en la tinción de las células de color rosa, y las esporas (estén dentro de la bacteria o fuera porque ya haya esporulado) de color verde.

Para facilitar la tinción de las esporas, se calienta la muestra, facilitando la penetración del colorante.

 

MATERIAL

• Papel de filtro
• Portaobjetos
• Pipeta pasteur
• Asa de siembra
• Mechero bunsen
• Barras paralelas
• Cubeta para tinciones
• Frasco lavador
• Rotulador permanente
• Mechero
• 2 vasos de precipitado
• Torunda:
  • Algodón
  • Esparadrapo
  • Gasa
  • Mango de asa de siembra
• Suero salino
• Alcohol
• Muestra (cultivo bacteriano con esporas)
• Colorantes:
  • Verde malaquita
  • Safranina

 

PROCEDIMIENTO

1. Encender el mechero bunsen par crear un área de esterilidad.
2. Coger un portaobjetos y colocar una gota de suero salino en el centro
3. Esterilizar con la ayuda del mechero bunsen el asa de siembra, introducirlo en el tubo de ensayo y coger una muestra representativa de la muestra.
4. Colocar la muestra sobre la gota de suero salino y extenderla por todo el portaobjetos.
5. Esterilizar de nuevo el asa de siembra por flameado con el mechero bunsen.
6. Fijar la muestra con el mechero bunsen por calor. Hasta que la muestra quede seca.
7. Apagar el mechero, puesto que la muestra ya esta fijada.
8. Colocar las barras paralelas encima de la cubeta de tinción.
9. Colocar el portaobjetos con la muestra a teñir fijada sobre las paralelas.
10. Preparar la torunda:
    1. Coger el mango de asa de siembra y colocarle en la punta la cantidad necesaria de algodón.
    2. Cubrir el algodón con una gasa, de manera que una parte de la gasa quede cubriendo solo el mango (para luego poder pillarlo).
    3. Pillar la gasa con esparadrapo al mango, para que quede en una sola pieza.
11. Preparar un vaso de precipitado con alcohol y otro con agua.
12. Aplicamos verde malaquita sobre la muestra con la ayuda de una pipeta pasteur, asegurandonos de que toda la muestra quede cubierta. impregnamos la torunda en alcohol y la encendemos con la ayuda de un mechero. Le damos calor hasta que veamos salir humo (cuando deje de salir humo volvemos a darle calor con la torunda). Dejamos actuar el colorante dandole calor con la torunda durante 5 minutos. Si se evapora todo el colorante, se le echa mas. Una vez pasado el tiempo, apagar la torunda introduciendola en agua.
13. Escurrir la muestra y aclarar con agua destilada con la ayuda de un frasco lavador.
14. Aplicar safranina sobre la muestra cubriendola por completo con una pipeta pasteur y dejar actuar durante 1 minuto.
15. Escurrir la muestra, aclarar con agua destilada y dejar secar al aire.

 

RESULTADOS

Los resultados son la tincion de las células de color rosa (por la safranina) y las esporas de color verde (por el verde malaquita).

 

INTERPRETACIÓN

En nuestro caso, los resultados han sido bastante buenos, y podemos distinguir perfectamente las bacterias de las esporas, y ver con claridad las que están dentro de la célula (endoesporas) y las que están fuera (exoesporas) porque ya han esporulado.

Las pocas células que se ven rosas, son aquellas que no poseen esporas, seguramente porque hayan esporulado, y eso justifica también el porque vemos esporas sueltas en el porta.

 

PRECAUCIONES

• Mantener el alcohol alejado del fuego.
• Asegurarnos de que la torunda impregnada en alcohol no gotee.
• En caso de introducir por error la torunda en el vaso con alcohol, tapar el vaso con otro de mayor tamaño para extinguir el fuego.