OBJETIVO
Determinación cuantitativa de Hemoglobina A1C en sangre total.
FUNDAMENTO
Esta determinacion se realiza mediante cromatografia, mas concretamente con una cromatografia en columna de intercambio ionico.
Las moléculas cargadas positiva o negativamente, se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico mediante buffers con diferentes pH o diferente fuerza iónica. De esta manera, conseguimos separar los componentes que componen una muestra, y seleccionar el que nos resulta de interes.
MATERIALES
- -Micropipeta
- -Puntas de micropipeta
- -Columnas de cromatografía de intercambio iónico
- -Baso de precipitado (residuos)
- -Tubos de ensayo
- -Gradilla para tubos de ensayo
- -Espectrofotómetro
- -Cubetas para espectrofotómetro
- -Reactivos:
Reactivo 1: Ftalato de potasio 50 mmol/L, detergente 5 g/L, azida de sodio 0,95 g/L, pH 5,0
Reactivo 2: Tampón fosfatos 30 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L
Reactivo 3: Tampón fosfatos 72 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L
Microcolumnas: Contiene resina de intercambio catiónico equilibrada con tampón fosfatos 72 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L
PROCEDIMIENTO
Preparación del hemolizado y la fracción lábil
Tenemos que dejar atemperar la columna unos minutos para que este a temperatura ambiente, entre 21 y 26ºC.
Para preparar el hemolizado, en un tubo de ensayo mezclamos 50 µL de sangre total y 200 µL del reactivo 1, lo agitamos y lo dejamos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Preparación de la columna
Quitamos la tapa de la parte superior de la columna y después la lengüeta de la parte inferior, permitiendo el paso del líquido de equilibrado de la columna, que desecharemos en un tubo.
Con la ayuda de la parte superior de una pipeta, empujar el filtro en forma de disco que contiene la columna hasta que esté en contacto con la resina, evitando comprimirla.
Dejar en reposo hasta que todo el líquido de equilibrado haya pasado por la columna.
Separación de la HbA1c
Colocamos sobre el disco ya en contacto con la resina 50 µL de hemolizado preparado previamente como se explica con anterioridad, y desechamos el eluido.
Una vez haya pasado el hemolizado por completo, añadimos 200 µL de reactivo 2, procurando arrastrar los posibles restos de la muestra que queden en la columna, y desechamos el eluido.
Cuando haya pasado todo el reactivo 2 por la columna, volvemos a echar reactivo 2, pero esta vez 2 ml, y volvemos a desechar el eluido.
Una vez pasado todo el líquido del paso anterior por la columna, añadimos 4 ml de reactivo 3, pero esta vez sí recogemos el eluido en un tubo limpio, puesto que aquí estará la fracción de HbA1c.
Para finalizar, agitamos bien el líquido obtenido con la HbA1c, ponemos 1 ml en una cubeta de espectrofotometría y medimos la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 415nm.
Lectura de HbTOTAL
En un tubo de ensayo, pipeteamos 12 ml de reactivo 3 y 50 µL de hemolizado, lo mezclamos bien, ponemos 1 ml en una cubeta de espectrofotometría y medimos con el espectrofotómetro a una longitud de onda de 415nm.
RESULTADOS
Para calcular la concentración relativa de la HbA1c, tenemos que aplicar la siguiente formula:
- AHbA1c = valor dado en la medición en el espectrofotómetro
- VHbA1c = 4mL
- AHbtotal = valor dado en la medición en el espectrofotómetro
- VHbtotal = 12 mL
En nuestro caso, los resultados obtenidos mediante la aplicación de esta fórmula son:
INTERPRETACIÓN
El resultado que hemos obtenido está dentro de los valores promedio, por lo que podemos decir que nos ha salido bien la práctica.
En este caso, según los resultados obtenidos, el paciente al que pertenece la muestra no tiene ningún problema de diabetes, puesto que la HbA1C está dentro de los valores normales.
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