OBJETIVO
Detección cualitativa de anticuerpos IgG de vaca (bovinos).
FUNDAMENTO
Se basa en una técnica ELISA directa, en la que la muestra se fija a un soporte, y se le añaden anticuerpos conjugados a una enzima a la que se añade un sustrato y da una coloración que detecta la presencia de los antígenos que se buscan si están presentes en la muestra.
MATERIALES
- Papel de filtro
- Cubeta de incubación
- Micropipeta
- Puntas de Micropipeta
- Vaso de precipitado
- Frasco lavador
- Placa de análisis (nitrocelulosa)
- Muestra: suero
- Reactivos:
- Anticuerpos anti-IgG bovina conjugada con peroxidasa
- Ovoalbúmina
- Tampón fosfato salino
- Sustrato/cromógeno
- Control +
- Control –
PROCEDIMIENTO
- Preparamos todo el material en la superficie de trabajo sobre un papel de filtro.
- Colocamos 5µL de los controles y las muestras sobre la placa de nitrocelulosa (cada suero en un pocillo diferente).
Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida - Dejar secar al aire hasta que desaparezca la gota.
- Preparar la solución de bloqueo vertiendo el contenido un sobre de ovoalbúmina sobre 50 µL de tampón fosfato salino y mezclar hasta conseguir una solución homogénea.
- Una vez secas las gotas de suero, se cubre la placa con la solución de bloqueo preparada en el paso anterior y esperamos 30 minutos.
Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida - Retiramos la solución de bloqueo y lavamos con abundante agua destilada y damos unas sacudidas para eliminar el exceso de agua y secar los bordes de plastico.
- Añadir a cada pocillo 20 µL del anticuerpo conjugado con peroxidasa
- Dejar incubando 10 minutos a temperatura ambiente.
- Lavamos con abundante agua destilada y damos unas sacudidas para intentar retirar la mayor cantidad de agua posible.
- Añadir a cada pocillo 50 µL de sustrato cromógeno.
- Dejar secar la placa para que salgan los resultados moviendo un poco la placa.
- Cuando los resultados de los colores sean claros, lavar con abundante agua y dejar secar para visualizar mayor contraste (cuando esta completamente seca se ve mucho mejor la coloración de los positivos).
RESULTADOS
Los posibles resultados son los siguiente:
- Negativo: el pocillo queda blanco sin cambio de coloración
- Positivo: el pocillo muestra un cambio de coloración y se observa morado
En nuestro caso, los resultados han sido todos positivos.
INTERPRATACIÓN
El resultado positivo indica la presencia de anticuerpo IgG bovinos, y el resultado negativo, la ausencia de los mismos.
Como hasta el control negativo, por lo que los resultados no son fiables, por lo que no podemos llegar a la conclusión de que las muestras analizadas contengan o no anticuerpos IgG bovinos. Esto se puede deber, a que los reactivos estaban caducados de hace mucho tiempo (varios años) por lo que la técnica seguramente no pueda salir correctamente.
PRECAUCIONES
- Respetar adecuadamente los tiempos para que los resultados sean lo mas precisos posibles.
- Cambiar las puntas de pipeta cada vez que se pipetea para evitar contaminaciones entre las distintas muestras y controles.
- Se recomienda esperar a que el soporte este totalmente seco para la lectura mas precisa de los resultados.
BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA
IMÁGENES: las imágenes aportadas a en este PNT para su realización son realizadas por mi en el laboratorio del instituto I.E.S. Albaida.
INFORMACIÓN:
- Protocolo obtenido del profesorado del instituto I.E.S. Albaida
- Wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:Portada
- Blog de laboratorio clínico: http://laboratorioareaclinica.blogspot.com/search/label/Tinciones%20bacteriol%C3%B3gicas
JFLAbclinico 