Técnica doble difusión

OBJETIVO

Detección de antígenos o anticuerpos en muestras biológicas.

 

FUNDAMENTO

Se basa en la capacidad de los antígenos y los anticuerpos de unirse de manera específica formando inmunocomplejos cuando se encuentra en estado de equivalencia, es decir, en concentraciones optimas para que se formen dichas uniones.

A este estado de equivalencia se llega al disminuir la concentración de antígeno o de anticuerpo que haya en la muestra como consecuencia de una difusión en una placa de Petri con agar, que es el soporte de la prueba.

 

MATERIALES

• Agar-agar
• Placas de Petri
• Micropipeta
• Puntas de micropipeta
• Pipeta pasteur
• Erlenmeyer
• Microondas
• Plantilla para pocillos
• Muestra: suero
• Reactivo: antigenos o anticuerpos especificos

Fuente: google imagenes

 

PROCEDIMIENTO

Primero, tenemos que prepara las placas de Petri con el agar y los pocillos, para ello, primero vamos a preparar el agar:

1. Con la ayuda de una balanza pesamos el agar según la cantidad que vayamos a preparar mirando las indicaciones que vienen en el envase.
2. Se mida la cantidad de agua necesaria con una probeta.
3. Se mezcla el agua destilada y el agar con una varilla agitadora en un vaso de precipitado.
4. Se pone la disolución a calentar en el microondas sin que llegue a hervir; retirar justo antes de que subo y se desborde del recipiente.
5. Verter el preparado en las placas Petri (cubrir toda la superficie); y dejar enfriar a temperatura ambiente.

Una vez están solidificado el agar, con la ayuda de una pipeta Pasteur y una plantilla, hacemos los pocillos donde depositaremos las muestras:

1. Colocamos la plantilla sobre una superficie plana y colocamos una placa Petri encima con el dibujo bien centrado.
   

   
2. Apretamos un poco la pipeta, hacemos el pocillo con la punta como si fuera un punzón, soltamos la pipeta para succionar el fragmento de agar que deseamos retirar.

   

   Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

3. Realizamos esto para hacer todos los pocillos en todas las placas de Petri.

Una vez listas las placas de Petri con agar y sus pocillos correspondientes hechos, ya podemos realizar la técnica en si, para ello, dependiendo de si queremos detectar anticuerpos o antígenos, colocaremos las muestras y los reactivos en unos pocillos o en otros:

Detección de anticuerpos

1. Se coloca suero problema (en el que se quiere saber la presencia o no de anticuerpos) en los pocillos externos.
2. Se coloca antígeno complementario a los anticuerpos que queremos buscar en la muestra en el pocillo central.
3. Se espera 48 horas para observar los resultados y mirar si se observa o no una linea de precipitación.

Detección de antígenos

1. Se coloca la muestra problema (en el que se quiere saber la presencia o no de antígenos) en los pocillos externos.
2. Se coloca el antisuero complementario a los antígenos que queremos buscar en la muestra en el pocillo central.
3. Se esperan 48 horas para observar los resultados y mirar si se observa o no una linea de precipitación.

Fuente: fotos tomadas por mi en el laboratorio de analisis clinico del IES albaida

 

 

RESULTADOS

En los resultados solo tenemos dos posibilidades:

• Aparición de una linea de precipitado: positivo.
• Ausencia de una linea de precipitado: negativo.

INTERPRETACIÓN

Si el resultado es positivo, indica la presencia de lo que estábamos buscando, ya fuesen antígenos o anticuerpos.

El tamaño y posición de la linea, nos indica de forma semicuantitativa la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra problema.

En nuestro caso, solo hubo dos placas en las que hubo precipitación, y fue en la que pusimos en contacto un anti-horse con suero de caballo y anti-bovine con suero de vaca.

 

PRECAUCIONES

• Etiquetar correctamente todo lo utilizado durante la practica.
• No contaminar muestras y reactivos.
• Leer bien las indicaciones de los reactivos y productos utilizados.
• Desechar correctamente los residuos.
• Atemperar los reactivos y las muestras utilizados.
• Asegurarnos de que no sobresalga la gota de muestra o reactivo de los pocillos, puesto que podría interferir en los resultados.
• Llenar las placas de petri con la cantidad correcta de agar.
• Usar guantes térmicos para evitar quemarnos en la elaboración del agar.

 

INFOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA

IMÁGENES: las imágenes aportadas a en este PNT para su realización son realizadas por mi en el laboratorio del instituto I.E.S. Albaida y google imagenes.

INFORMACIÓN:

• Protocolo obtenido del profesorado del instituto I.E.S. Albaida
• Wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Wikipedia:Portada
• Blog de laboratorio clínico: http://laboratorioareaclinica.blogspot.com/search/label/Tinciones%20bacteriol%C3%B3gicas